玉溪sgrna设计网站结果是什么,sgRNA设计的注意事项

sgRNA设计的注意事项

CRISPR-Cas9是一种可以编辑基因组特定靶基因的DNA操作技术。 该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,Cas9蛋白在sgRNA的诱导下切取靶部位的DNA双链,产生平末端双链DNA缺失,启动DNA损伤修复机制。 通过非同源末端链(Non-homologous end joining,NHEJ )或同源重组) Homologous recombination,HR )连接断裂上下游两端的序列。

目前,CRISPR-Cas9基因编辑技术在疾病基础研究、靶点验证、药物分子高通量筛选、遗传性疾病的治疗等领域得到越来越广泛的应用。sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用,其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等,甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此,设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。

sgRNA设计的一般流程如下:

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图1. sgRNA的设计过程

靶基因信息的分析

查询靶基因信息常用的数据库有NCBI、Ensembl等,在检索中注意物种选择和靶基因在数据库中的注册号码,避免检索错误。 查阅目的基因信息后,需要进一步关注其所在基因座的下游基因状况、转录本的数量、埃克森的数量和长度、翻译起始位点和终止位点等信息。 然后,综合考虑这些信息进行下一步骤的sgRNA设计。

这里给出了调查人类Rag1基因的例子。 在NCBI Gene数据库中输入应该检索的人Rag1基因,检索的结果显示了多个含有不同种类Rag1同源基因的与Rag1相关的基因。 因此,需要注意该基因在NCBI上的注册编号和属种的记述等(图2a )。 点击目标基因人类Rag1基因,就会显示该基因的基本信息。

可以用“下载数据”下载该基因的相关序列。 在“See related”中,可以看到该基因在Ensembl数据库中的相关信息,主要是为了看到该基因的转录本相关信息(图2b )。 如果链接到Ensembl数据库,可以找到有关该基因的转录本数量等信息。 这里显示,人类Rag1基因有3个转录本,可以打开其中一个转录本查看相关信息(图2c )。 调查RAG1-201转录本的信息,打开左侧的“Exons”可以看到该转录本的埃克森等相关的信息(图2d ),可以显示该转录本的基本结构(图2e )。

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图2 .靶基因信息的分析

靶区域的选择原则

以敲除(KO )为例,敲除可以采用两种不同的策略——码移动突变和片段敲除,不同的策略对靶区选择的参考标准不同,但需要遵循以下原则。

1. 不影响其他基因,尤其是编码蛋白的基因。在选择靶区时,不选择与其他基因重叠的区(图3a )。

2. 尽可能影响所有的转录本,击倒部位最好在代码区域的前50%,但不要击倒ATG所在的位置(图3b )。

3. 能影响蛋白的功能结构域。

对于片段敲除,需考虑更多因素:,例如,通过片段的敲除而被敲除的埃克森的代码序列之和为3以外的倍数(图3c ),从而在靶区后面的序列中产生转码,功能蛋白质为翻译, 代码段的剔除在选定的剔除区域为10Kb以下,如果超过10Kb,则编辑效率会下降。 被碎片敲除的gRNA被设计为内含子,可以敲除整个埃克森区域,避免残留蛋白质的翻译。 另外,通过使gRNA的设计部位接近被敲除的埃克森,可以避免产生不可控的剪切信号而形成新的转录本。 剔除区域的前后序列尽可能简单,便于后续的PCR鉴定。

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图3 .目标区域的选择图像

(a )基因a和基因b共享一个外显子(显示蓝色的外显子),所以在选择靶区时,遵循不影响其他基因的原则,不将共享的外显子作为靶区。 ) b )在存在多个转录本的情况下,为了能够剔除所有的转录本,要选择存在于多个转录本中、且代码区域前50%的埃克森(在此为红色标记的埃克森)作为目标区域。 (c )在片段基因敲除的情况下,由于基因片段太大无法全部敲除,因此决定敲除外显子的一部分,由于敲除片段的编码序列之和不是3的倍数,后面的蛋白质会发生转码突变。

gRNA的设计

目前有较多提供gRNA设计的在线工具,常用的如张锋实验的CRISPOR(http://crispor.tefor.net/),输入目标序列,选定与种属基因组对应的PAM,即可获得多个gRNA和各自gRNA对应的特异性、剪接效率和潜在靶标位点,一般特异性、剪接效率得分较高。

需要手动设计gRNA时,需要考虑其特异性和切断效率。 靶的设计时必须综合考虑所有候选靶的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的偏离靶位置等信息。

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图4. CRISPOR在线网页设计sgRNA流程

脱靶分析

根据所选择的sgRNA,通过生物信息学方法进行sgRNA的解靶分析。 CCTop (

输入359 CCtop.COS.uni-Heidelberg.de :8043/SG RNA序列,选定相应的属基因组进行分析(图5 )。 然后检查得到的遗传材料。 选择前10个潜在的关注部位,通过PCR序列验证是否为关注部位。 在实验要求严格的情况下,需要通过全DNA测序鉴定脱靶情况。

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图CCTop联机页面中5. sgRNA的脱靶分析

sgRNA的设计,你废了吗? 但是,这只是基因编辑程序设计的一环,基因编辑程序需要考虑目标基因转录本分析、转染方法、细胞克隆形成能力等多种因素,非常熟练的程序设计专家需要几个小时或

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